Nel primo volume della serie di articoli sulle MIC (concentrazioni minime inibenti) abbiamo approfondito in cosa consistono i valori di MIC “veri” o “reali”. Abbiamo constatato che la maggior parte dei sistemi ID/AST disponibili in commercio non sono conformi ai protocolli sul metodo MIC di riferimento 20776-1:2006 (E)1 dell’Organizzazione internazionale per la standardizzazione (ISO) e M07-A10 dell’Istituto per gli Standard Clinici e di Laboratorio (CLSI). Le case produttrici dei sistemi automatizzati devono, pertanto, produrre dati sulle prestazioni derivanti da studi clinici per confermare l’equipollenza con il metodo di riferimento, in modo da disporre di evidenze che sostengano che i valori di MIC generati siano “veri” o “reali”. In questo articolo esamineremo la tipologia di dati preliminari raccolti dal sistema VITEK® 2 e come questi vengono convertiti in valori di MIC accurati.

Come viene monitorata la crescita dei microrganismi?

Gli isolati dei pazienti vengono testati con VITEK® 2 utilizzando una singola card AST monouso (Fig. 1) per ogni isolato. Ogni card contiene almeno un pozzetto di controllo positivo privo di antibiotico (solo brodo di coltura) e diversi pozzetti con concentrazioni crescenti di diversi antibiotici nel brodo.

VITEK® 2 monitora costantemente la crescita in tutti i pozzetti. Nel pozzetto di controllo positivo, la crescita viene monitorata fino al rilevamento di una minima quantità predefinita di crescita batterica attraverso la misurazione della torbidità (variazione percentuale delle RTU – %ΔRTU). La crescita nel pozzetto di controllo indica che gli isolati testati sono attivi e che crescono a una velocità adeguata per avviare l’analisi dei diversi pozzetti contenenti il farmaco. L’analisi prosegue ogni 15 minuti fino al completamento del test di sensibilità.

Come mostrato nella Fig. 2 , la crescita dei microrganismi viene misurata in diversi modi sia nel pozzetto di controllo positivo sia nei pozzetti contenenti antibiotico. La crescita relativa di ogni microrganismo in ogni pozzetto contenente antibiotico viene, poi, confrontata con la crescita osservata nel pozzetto di controllo positivo.

 


Figura 1: Card per AST VITEK® 2
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Figura 2: Principio delle MIC VITEK® 2
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Come viene determinata la MIC?

La MIC viene determinata confrontando la crescita dell’isolato del paziente con la crescita degli isolati con MIC note. È come se in VITEK® 2 fosse memorizzata una curva standard che permette di raffrontare le MIC di riferimento con l’attività del microrganismo nei pozzetti contenenti antibiotico.

È importante notare che le “curve standard” in VITEK® 2:

  • Sono multidimensionali, in quanto VITEK® 2 considera costantemente parametri multipli (a differenza della lettura a endpoint singolo dopo l’incubazione notturna)
  • Sono state sviluppate utilizzando >1800 organismi Gram-negativi e >1200 organismi Gram-positivi con diversi meccanismi di resistenza

Poiché VITEK® 2 considera costantemente la crescita nel corso del tempo e si avvale di molteplici parametri per esaminare la crescita (a differenza della lettura a endpoint singolo dopo l’incubazione notturna), non è necessario utilizzare un pozzetto per ogni MIC che può essere riportata. Un singolo pozzetto è in grado di fornire informazioni per più di una MIC in quanto l’attività del microrganismo nel pozzetto può essere interpretata su una scala caratterizzata da una valenza informativa maggiore rispetto al semplice rilevamento o meno della crescita.

Qual è il vantaggio del monitoraggio continuo?

Per spiegare il vantaggio del monitoraggio continuo dell’attività dei microrganismi, bisogna considerare che il test AST VITEK® 2 AST può segnalare le MIC in diluizioni a raddoppio per un range di concentrazione antibiotica ≤0,25 μg/mL e ≥8 μg/mL. I grafici da 1 a 6 mostrano la relazione tra i dati generati dal sistema VITEK® 2 e i risultati ottenuti attraverso un metodo di riferimento.

Ogni grafico rappresenta la crescita rilevata dal sistema VITEK® 2 per uno specifico microrganismo con diverse MIC di riferimento. Una delle prime considerazioni che emerge osservando i grafici è che possiamo interpretare l’attività di crescita alle varie concentrazioni di antibiotico in modo più efficace rispetto alla mera rilevazione della presenza o meno di crescita. Con sole tre concentrazioni, VITEK® 2 può distinguere sei pattern di crescita unici e riportare sei MIC differenti.

Un’altra funzione fondamentale dell’analizzatore VITEK® 2 è la capacità di standardizzare i dati relativi a un microrganismo testato e di confrontare ogni concentrazione antibiotica con la crescita nel pozzetto di controllo. Questa fase è significativamente importante per determinare la crescita relativa del microrganismo, in quanto la forma delle curve di crescita varia a seconda del tipo di microrganismo. La durata della fase di latenza, la pendenza e l’entità della variazione durante la fase esponenziale concorrono ad attribuire al microrganismo una peculiare serie di caratteristiche di crescita.

Per comprendere il processo di standardizzazione dei dati si osservi, ad esempio, la crescita nel pozzetto da 0,5 μg/mL rispetto alla crescita nel pozzetto di controllo nel Grafico 2. Questo microrganismo è caratterizzato da una MIC di riferimento pari a 0,5 μg/mL. La crescita nel pozzetto da 0,5 μg/mL è circa il 60% di quella del pozzetto di controllo. Nel Grafico 3, invece, il microrganismo saggiato è caratterizzato da una MIC di riferimento di 1 µg/mL e l’attività nella concentrazione da 0,5 μg/mL è pari al 95% mentre l’attività nella concentrazione da 2 μg/mL è pari al 8% (crescita praticamente inibita). Queste percentuali, o valori di crescita relativi del microrganismo, sono utilizzate da VITEK® 2 per determinare MIC precise.

 

 


Grafici 1-6
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Ad esempio, la Tabella 1 sottostante sintetizza l’analisi di VITEK® 2 della crescita relativa del microrganismo per i dati dei Grafici 1-6. Viene mostrato il rapporto numerico tra la crescita del microrganismo determinata con VITEK® 2 e il metodo di riferimento delle MIC.

Microrganismo/GraficoMIC di riferimentoConcentrazione antibiotica
0.52.08.0
1≤ 0.253%2%1%
20.560%3%1%
31.090%8%2%
42.095%50%8%
54.099%92%9%
6≥ 8.0100%100%99%
 Tabella 1: Crescita relativa del microrganismo in un pozzetto contenente antibiotico rispetto alla crescita nel pozzetto di controllo espressa in percentuale
Tracciando i valori della crescita relativa del microrganismo con un ampio set di microrganismi per le 3 concentrazioni antibiotiche mostrate nella Tabella 1 (0,5, 2 e 8 μg/mL), si ottiene il Tracciato 1 che funge da curva standard e in cui:
  • Ogni dimensione rappresenta la crescita relativa in una concentrazione di antibiotico
  • Ogni rombo rappresenta il punto corrispondente ai tre valori di crescita relativa del microrganismo per un dato microrganismo
  • I diversi gruppi di colore rappresentano un set di microrganismi con MIC di riferimento che variano da ≤0,25 μg/mL a ≥8,0 μg/mL.

 

Tracciato 1: Crescita relativa del microrganismo in un ampio set di microrganismi
Ogni rombo rappresenta un singolo microrganismo

 

Ad esempio, il rombo relativo ai dati corrispondenti alla Tabella 1 – Microrganismo/Grafico 3 si troverebbe alle coordinate (90%, 8%, 2%). Il 90% sarebbe tracciato sull’asse 0,5 μg/mL, l’8% sull’asse 2,0 μg/mL e il 2% sull’asse 8,0 μg/mL. Dato che questo microrganismo ha una MIC di 1,0 μg/mL, il colore del rombo sarà rosso (in base alla legenda dei colori delle MIC di riferimento presente nell’area in alto a destra del tracciato). Nel complesso, il tracciato tridimensionale mostra la peculiare capacità di VITEK® 2 di differenziare sei MIC distinte con sole tre concentrazioni di antibiotico. Inoltre, si può osservare come la determinazione della crescita relativa del microrganismo consenta al sistema VITEK® 2 di considerare le peculiari caratteristiche di crescita di ogni microrganismo per determinare la MIC.

Il monitoraggio continuo dellattività dei microrganismi aiuta a determinare le MIC e il tempo di incubazione necessario per il microrganismo nel sistema VITEK® 2. La conoscenza di quando un microrganismo passa dalla fase di latenza alla fase esponenziale, permette al software di analisi di determinare il tempo di incubazione appropriato sulla base della crescita esibita da ogni organismo. La procedura è la seguente:

  1. Il sistema VITEK® 2 si aspetta una fase di latenza con un tempo predefinito nel pozzetto di controllo della crescita,
  2. Dopodiché, VITEK® 2 verifica se la crescita è avvenuta nel pozzetto con concentrazione più bassa di antibiotico,
  3. Se durante questo intervallo di tempo la crescita è ancora in corso, VITEK® 2 prolunga l’incubazione per un altro periodo di tempo predefinito in modo da valutare la crescita in corso nelle concentrazioni rimanenti superiori.
  4. Questo processo di prolungamento continua finché:
    • non si osserva un’ulteriore crescita significativa, oppure
    • si osserva una crescita nella concentrazione più elevata

Grazie a questo processo, VITEK® 2 necessita di un periodo di incubazione relativamente breve per la maggior parte dei microrganismi in quanto, alla fine, è il comportamento di crescita del microrganismo che detta la durata dell’incubazione. Lo strumento procede con gli adeguamenti solo una vota rilevata la crescita, con l’ulteriore vantaggio di consentire la rilevazione della resistenza ritardata.

Che cosa si può concludere?

L’approccio di VITEK® 2 per la determinazione delle MIC tradisce la tradizione, ma la tradizione non è un obiettivo scientifico. Al contrario, è importante cercare sempre nuovi modi più efficienti e accurati di operare. La funzionalità di VITEK® 2 di costante monitoraggio dell’attività dei microrganismi per determinare in maniera precisa la durata dell’incubazione e la MIC è più rapida dei metodi tradizionali. Nel corso di valutazioni in studi clinici, è stato dimostrato, ripetutamente, che questo metodo offre risultati accurati e riproducibili.