Na primeira publicação desta série de artigos sobre CMIs (Concentrações Mínimas Inibitórias) focámo-nos sobre o que constituem valores de CMI “verdadeiros” ou “reais”. Vimos que a grande maioria dos sistemas automatizados ID/AST comercializados não aderem à International Organization for Standardization (ISO) 20776-1:2006 (E)1 ou Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M07-A10 reference method MIC protocols. Os fabricantes dos sistemas automatizados precisam de fazer ensaios clínicos para estabelecer qual o desempenho do equipamento vs o método de referência. Assim sendo, isto implica que  se existe uma validação com o método de referência, as CMIs obtidas  são verdadeiramente reais. Neste artigo, iremos explorar o tipo de dados brutos recolhidos pelo VITEK® 2 e como isso é convertido em valores de CMI exatos.

Como é o crescimento do microrganismo monitorizado?

Os isolados dos pacientes são testados no VITEK® 2 usando uma carta AST descartável, independente e única (Figura 1) por isolado. Cada carta contém, pelo menos, um poço de controlo positivo sem antibiótico (apenas caldo de promoção de crescimento) e poços múltiplos com concentrações crescentes de vários antibióticos em caldo.

O VITEK® 2 monitoriza continuamente todos os poços. O crescimento do poço do controlo positivo é monitorizado até um valor mínimo predeterminado de crescimento bacteriano ser detetado através de medições de turvação (i.e. alteração de percentagem de unidades de transmitância brutas – %ΔRTU). O crescimento no poço de controlo mostra que o isolado do teste é viável e o crescimento num rácio apropriado para iniciar a análise nos vários poços de antibióticos. Esta análise continua todos os 15 minutos até o teste de suscetibilidade se completar.

Como a Figura 2 demonstra, o crescimento do microrganismo é medido de várias formas tanto no poço do controlo positivo como nos poços de antibióticos. O crescimento relativo do microrganismo em cada poço de antibiótico também é comparado com crescimento no(s) poço(s) de controlo positivo.

 


Figura 1: Carta AST VITEK® 2
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Figura 2: Princípio das CMIs do VITEK® 2
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Como é a CMI determinada?

A CMI é determinada através da comparação do crescimento do isolado do paciente ao crescimento dos isolados com CMIs conhecidas. É como ter uma curva padrão armazenada no VITEK® 2, onde a curva padrão se relaciona com CMIs de referência para a atividade dos microrganismos nos poços de antibióticos.

É importante notar que as “curvas padrão” no VITEK® 2:

  • São multidimensionais, uma vez que o VITEK® 2 está continuamente a verificar múltiplos parâmetros (como oposto a uma leitura única de ponto final após incubação durante a noite)
  • Foram criadas utilizando >1800 microrganismos gram-negativos e >1200 microrganismos gram positivos com vários mecanismos de resistência

Tendo em conta que o VITEK® 2 está continuamente a verificar o crescimento no decorrer do tempo e a usar múltiplos parâmetros para examinar o crescimento (por oposição a uma única leitura de ponto final após incubação durante a noite), não é necessário ter um poço para cada CMI que pode ser reportada. Um único poço é capaz de fornecer informação de mais do que uma CMI porque a atividade do microrganismo num poço pode ser interpretada numa escala que dá mais informações do que apenas o crescimento ou não crescimento.

Qual o valor da monitorização contínua?

Para ilustrar o valor da monitorização contínua da atividade do microrganismo, vejamos um teste AST VITEK® 2 AST que pode dar relatórios de CMIs de dupla diluição para um intervalo de concentração de antibiótico de ≤ 0.25 μg/ml a ≥ 8 μg/ml. Os Gráficos 1 a 6 illustram a relação entre os dados gerados por um Sistema VITEK® 2 para resultados obtidos por um método de referência.

Cada gráfico mostra o crescimento como observado pelo Sistema VITEK® 2 para um microrganismo específico com CMIs de referência diferentes. Uma das primeiras observações de leitura dos gráficos é que podemos interpretar a atividade do crescimento nas várias concentrações de antimicrobianos, mais efetivamente do que apenas verificar o crescimento ou a ausência do mesmo. Com apenas três concentrações, o VITEK® 2 pode detetar seis padrões de crescimento únicos que permitem reportar seis CMIs diferentes.

Outra função importante da análise do VITEK® 2 é a capacidade de padronizar dados para testar um microrganismo através da comparação do crescimento em cada concentração antimicrobiana em relação ao crescimento no poço de controlo. Esta etapa é essencial para determinar o crescimento relativo do microrganismo, visto que a forma das curvas de crescimento é diferente para diferentes tipos de microrganismos. O comprimento da fase de latência, o declive da alteração durante a fase exponencial, tudo contribui para dar a um microrganismo uma configuração única de características de crescimento.

Para compreender o processo de padronização de dados, veja, por exemplo, o crescimento no poço de 0.5 μg/ml comparado com o crescimento no poço de controlo no Gráfico 2. Este microrganismo tem uma referência de CMI de 0.5 µg/ml. O crescimento em 0.5 μg/ml é de aproximadamente 60% em relação ao crescimento do poço de controlo. No entanto, no Gráfico 3, o microrganimo tem  referência de CMI de 1 µg/ml e a atividade na concentração de 0.5 μg/ml é de 95% dessa no meio de crescimento apenas. Estas percentagens, ou valores de crescimento de microrganismos relativos são utilizados no VITEK® 2 para determinar as CMIs exatas.

 


Gráficos 1-6
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Por exemplo, o Quadro 1 abaixo resume a análise do VITEK® 2 de crescimento relativo de microrganismos para os dados nos Gráficos 1 a 6. Demonstra a relação numérica entre o crescimento do microrganismo como determinado pelo  VITEK® 2 e o método de referência de CMIs.

Microrganismo/GráficoCMI de referênciaConcentração antimicrobiana
0.52.08.0
1≤ 0.253%2%1%
20.560%3%1%
31.090%8%2%
42.095%50%8%
54.099%92%9%
6≥ 8.0100%100%99%

Quadro 1: Crescimento Relativo de Microrganismo num poço antimicrobiano comparado com o crescimento no poço de controlo expresso em percentagem

Através da delineação dos valores do crescimento relativo do microrganismo com um vasto leque de microrganismos para as 3 concentrações de antimicrobianos demonstradas no quadro 1 (0.5, 2 e 8 μg/ml), obtivemos a Curva 1. A Curva 1 serve como curva padrão, e:
  • Cada dimensão representa o crescimento relativo numa concentração do antimicrobiano
  • Cada “símbolo” representa o ponto correspondente aos três valores de crescimento relativos de microrganismo para um determinado microrganismo
  • Os diferentes conjuntos de cores representam um conjunto de microrganismos com CMIs de referência que vão desde ≤ 0.25 μg/ml a ≥ 8.0 μg/ml.

Conjunto 1: Crescimento Relativo de Microrganismo sobre um Grande Conjunto de Microrganismos
Cada diamante representa um único microrganismo

Como exemplo, o diamante para os dados que correspondem aos Quadro 1 – Gráfico 3 estariam no ponto (90%, 8%, 2%). Os 90% estariam delineados no eixo 0.5 μg/ml, os 8% no eixo 2.0 μg/ml, e os 2% no eixo 8.0 μg/ml. Visto este microrganismo ter uma CMI de 1.0 μg/ml, a cor do diamante seria vermelha (baseada na cor chave da CMI de referência fornecida na área direita superior do gráfico). Em geral, o gráfico tridimensional ilustra a capacidade única do VITEK® 2 para diferenciar entre seis CMIs diferentes com apenas três concentrações de um antimicrobiano. Adicionalmente, vemos como a determinação do crescimento relativo do microrganismo permite ao sistema VITEK® 2 contabilizar as características de crescimento únicas de cada microrganismo para determinar a CMI.

A monitorização continua da atividade do microrganismo ajuda a determinar as CMIs  bem como o tempo de incubação necessário para um microrganismo no sistema VITEK® 2. Sabendo quando um microrganismo transita da fase de latência para a fase exponencial, a análise do software pode determinar o tempo de incubação apropriado baseado no crescimento apresentado para cada microrganismo. Vamos explicar como:

  1. No final da fase de latência no poço de controlo do crescimento, o VITEK® 2 espera um período de tempo predeterminado
  2. O VITEK® 2 verifica então se o crescimento ocorreu na concentração mais baixa do antibiótico
  3. Se o crescimento continuar a ocorrer durante este intervalo, o VITEK® 2 estende a incubação para um período de tempo predeterminado de modo a avaliar o crescimento que ocorre nas restantes concentrações.
  4. Este processo de extensão continua até:
    • Não haver mais crescimento significativo, ou
    • Até o crescimento ser visto na concentração mais alta

Utilizando este processo, o VITEK® 2 tem a capacidade de utilizar um  tempo de incubação relativamente curto para a maior parte dos microrganismos visto que, no final, é o microrganismo que dita o período de incubação. O aparelho ajusta este tempo dependendo do crescimento detetado. Assim, isto tem o benefício adicional de permitir a deteção de resistência tardia.

Qual é o resultado final?

A abordagem do VITEK® 2 para determinar os pontos de CMIs não é tradicional – mas a tradição não é o objetivo na ciência. Ao contrário, devemos sempre procurar caminhos mais eficientes, efetivos e exatos para fazer as coisas. A capacidade do VITEK® 2 em continuamente monitorizar a atividade do microrganismo para identificar o período de incubação e determinar a CMI, é mais rápido do que os métodos tradicionais. Durante as avaliações dos estudos clínicos, foi demonstrado – repetidamente – que este processo fornece resultados reproduzíveis e exatos.